Neuroendokrin rák xenograft

Bevezetés Az androgén-deprivációs terápiák ADT a prosztata rákos megbetegedések neuroendokrin rák xenograft. Az ADT eredetileg hatásos, de a daganatok nagy része visszaesik a kasztrálás-rezisztens prosztatarákkal CRPCamelyből a legtöbb beteg végül meghal.

Xenografts and Allografts: Allies in our war on cancer

Az új generációs erős AR-útvonal-gátlók, például az abirateron és az enzalutamid közelmúltbeli bevezetésével az NEPC előfordulási gyakorisága megnövekedett, ami a gyenge kimenetelhez kapcsolódik 4, 5. Egy másik, az NEPC-hez potenciálisan fontos közvetítő a 2-es polimer PRC2 represszív komplex, amely a H3 H3K27me3 10, 11 hiszton es tri-metilező lizinjével transzkripciós repressziót hoz létre.

A hiszton jelzés katalizálásának fő enzimje az EZH2 fokozott zeste homológ 2 12, amelyet több szilárd 11, 13 tumorban expresszálnak. Ismert, hogy az EZH2 túlzott expressziója a prosztataráksejtekben elősegíti a prosztatarák sejtproliferációját és migrációját Az angiogenezis döntő szerepet játszik a prosztatarák túlélésében, progressziójában és metasztázisában Ismert, hogy az NEPC erősen vaszkuláris 18, Az angiogenezis egy olyan bonyolult folyamat, amely függ az egyensúlyt az angiogenezis aktivátorai és inhibitorai között.

Nem ismert azonban, hogy az joghurt hasmenés angiogén inhibitorok milyen szerepet játszanak az NEPC-ben az angiogenezis szabályozásában, és hogy az EZH2 túlzott expressziója az NEPC sejtekben hozzájárul-e az angiogenezishez. Hatékonyan gátolja az angiogenezist az endotélsejtek migrációjával és túlélésével, és szuppressziója fokozott angiogenezist eredményez DHT dihidrotesztoszteron 1a.

Az NE1. A PCR-eredményekben a hibarészek háromszoros kísérletek standard deviációját sd képviselik. Amint az 1e.

Béta-aktint és a teljes hisztont 3 H3 is vizsgáltuk töltésszabályozóként.

Ezek a fehérjék azonban nem kapcsolódtak közvetlenül az NEPC-hez és a prosztatarák progressziójához. Amint az a 3a. Ábra bal panel és a kiegészítő ábra 1a. Ábra jobb oldali panel és a kiegészítő ábra 1b. Ábra és a 22Rv1 sejtekben kiegészítő ábra 2a megszünteti. Hasonló eredményeket figyeltünk meg egy másik AR-pozitív 22Rv1 sejtvonalban Kiegészítő ábra 2a.

Az IHC-adatok összefoglalása az 1. Ábra és 1. Kiegészítő ábra. Ismert, hogy az NEPC erősen angiogén Nem volt világos, hogy az EZH2 expresszió rákos sejtekben kritikus-e az angiogenezis neuroendokrin rák xenograft. Érdekes, hogy a TSP1 a prosztataráksejtekben potenciális EZH2 repressziós célpontként azonosított gének közé tartozik, további validálás nélkül Az Y -axisra ábrázolva a szentjános luciferáz jelek és a renilla luciferáz kontroll jelek arányai az egyes kezeléseknél.

És 3a. Ábra és kiegészítő ábra 3c. Ábra és Kiegészítő 4. Ezt a szélesebb körű implikációt támogatva az EZH2 és a TSP1 expresszió negatívan korrelál egymással több nagy TCGA szilárd tumor adathalmazban, mint például a mell, a gyomor és a vastagbélrák, valamint a tüdő laphámrák 6e.

Ábra és a 3d. A P értékek páratlan kétfedelű Student t tesztből származnak.

Brit regénynapló (Október 2020)

Minden érték átlag ± szórás. A Spearman korrelációs koefficiens Rho és a hozzájuk tartozó P értékek minden szórási területre vonatkoztak. A betegmintákból származó további eredmények a 3. Ábra, b. Egy független vizsgálatban a génexpressziós profilok bányászata során azt is megállapítottuk, hogy a TSP1 szabályozva van, míg az NE markerek szabályozottak, amikor az LNCaP sejteket hosszú távon CSS táptalajon tenyésztettük 43 7d.

Nevezetesen ugyanazokat az expressziós tendenciákat figyeltük meg egy 44 LNCaP xenograft tumor adatsorozatban, ahol az LNCaP sejt eredetű xenograftok a második generációs androgén receptor célzott terápiával, az enzalutamiddal kezelt kezelésből kiléptek, és NEPC lettek 7e.

Ábrahasonlóan a 7a. Ábrához LNCaP sejtekhez. Ábraamelyet az EZH2 egyidejű csendje mentett meg 8e. A jelzett fehérjék szintjét Western-blottal mértük.

• A háziorvosi gyakorlat számára fontos laboratóriumi preanalitikai tényezők Ezen anyagok némelyike specifikus klinikai tünetegyüttest okoz.
• Az adenovírus genomból származó INSM1 promoter specifitásának előre nem látható interferenciáját figyeltük meg.

Amint a 8h. Ezt követően közvetlenül meghatároztuk az EZH2 expressziónak a rákos sejtekben az angiogenezishez való hozzájárulását.

Továbbá meghatároztuk, hogy a CREB jelzés blokkolása esetén a prosztataráksejtekben a TSP1 indukció kritikus-e az angiogenezis gátlásához. Amint az várható volt, a hatékony shTSP1-t expresszáló PC3 kondicionált tápközeg több endotélsejt-migrációt vonz, mint a PC3-romboló sejtekből.

A fenti eredményekkel összhangban az angiogenezis csőképző vizsgálatokból származó, a CREB jelátviteli inhibitorokkal és az ICI-vel kezelt PC3-sejtek állapot-tápközege kevesebb migrált SVEC sejtet von maga után, mint a kezeletlen PC3 sejtek feltételes tápközege 9f. Ezt követően a PC3 sejtek kondicionált tápközegét CM használtuk szérum éheztetett SVEC endothelsejtek tenyésztésére, amelyek a növekedési faktoron levő sejtekbe csökkentették a Matrigel-t angiogenezis csőképző vizsgálatra.

A vizsgálatokat legalább kétszer végezzük hasonló eredményekkel. Két kísérlet reprezentatív képe látható. PRO NE1. A tumor növekedési neuroendokrin rák xenograft ezekben az egerekben biolumineszcenciás képalkotással figyeltük meg.

A CDX-növekedés Ábra és 5a. Az Y -axison a BLI-jelek átlagos, a Jobb panel: az LNCaP xenograft daganatok fotóképe a három csoportban áldozatul. Az ábrához kapcsolódó további adatok az 5.

Ábraami összhangban van az emberi pozitív pozitív korrelációval betegminták 3g. Ábra, 5b. És 5c.

A neuroendokrin daganatok biokémiai markerei

Ábra, f. Vizsgálatunk egy NE szabályozási utat köti össze az angiogenezissel és kritikus új betekintést nyújt az NEPC progresszió mechanizmusaiba.

Ez a munka a CREB aktiválása és az EZH2 által közvetített epigenetikai szabályozás közötti korábban nem elfogadott kapcsolatot mutatja be. Bár ezek a két biológiai folyamat kritikus fontosságúak a CRPC és az NEPC fejlesztéséhez 8, 26, 47, és ezért várhatóan összehangoltak, ezt korábban nem bizonyították.

Másrészt a CREB-t általában úgy tekintik, mint egy epigenetikus aktivátort, mivel aktiválása hiszton acetil-transzferázt, CBP-t toboroz hisztonok acetilálására és aktiválja a transzkripciót Érdekes lenne meghatározni, hogy a pályánk milyen mértékben kapcsolódik ezekhez az ismert NEPC szabályozókhoz.

Az NEPC erősen angiogén 18, Nem volt ismert, hogy az angiogenezis és a neuroendokrin fenotípus milyen kapcsolatban van, és milyen endogén angiogén gátlók vesznek részt az angiogenezis szabályozásában az NEPC-ben. Még mindig nem világos, hogy az EZH2 indukálja-e az NE marker expresszióját, amelyet laborunkban vizsgálunk.

Kimutatták, hogy az EZH2 szerepet játszik az endotélsejtek angiogenezisében. Lu és mtsai. Kottakis és mtsai. Az Még nemi szemölcs krémmel történő kezelés nem volt világos, hogy az EZH2 túlzott expressziója a rákos sejtekben hozzájárul-e az angiogenezishez. Kimutattuk, hogy az EZH2 elnémítása vagy az EZH2 inhibitorok kezelése rákos sejtekben gátolja az endotélsejtek in vitro angiogenezisét, amely közvetlen bizonyítékokat támaszt az EZH2 szerepével az angiogenezist elősegítő rákos sejtekben.

Ábraamely tovább támogatja az angiogenezis és a neuroendokrin fenotípus közötti intim kapcsolatot. Jelenleg nem áll rendelkezésre hatékony kezelés az NEPC számára. Elképzelhető, hogy az EPZ vagy más EZH2 gátlók bizonyos hatékonysággal rendelkezhetnek az NEPC kezelésében, amelyet formálisan meg kell vizsgálni további preklinikai és klinikai vizsgálatokban. Ez az eredmény összhangban van a CREB jelzés kritikus szerepével az NE fenotípusban és az angiogenezisben, amint azt mi és mások 7, 8, 36, Epidemiológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a béta-blokkolók, különösen a PRO alkalmazása a szív- és érrendszeri betegségekben egyes rákos betegeknél több klinikai kimenetelhez vezetnek többféle ráktípusban, mint például melanoma, prosztata, tüdő és mellrák 57, 58, Ezek a rákos betegekkel végzett retrospektív vizsgálatok összhangban vannak a PRO daganatellenes hatását a rákos sejtek tenyészetében és az egér xenograftokban 60, 61, Tekintettel arra, hogy a béta-blokkolókat évtizedek óta biztonságosan használják a magas vérnyomás és a szívbetegségek kezelésére, eredményeink arra utalnak, hogy a béta-blokkolók új terápiává válhatnak az NEPC számára, valószínűleg neuroendokrin rák xenograft rákterápiával kombinálva.

A clintrials. A fő akadálya a PRO hatásmechanizmusának egyértelmű megértésének hiánya in vivo, valamint a biomarkerek hiánya a páciens kiválasztására és hatékonyságának neuroendokrin rák xenograft 58, Ennek az útnak a tevékenysége a páciensek kiválasztásának és hatékonyságának monitorozásához is biomarkerekké válhat, ami további tanulmányokat igényel a jövőben.

A lineage plaszticitása elősegíti a terápiás céltól függő ráksejt átalakítását egy másik sejtre, amely közömbös a célfunkcióval. Valamennyi sejtvonalat rutinszerűen megerősítettek, hogy mikoplazma-mentesek a Lonza MycoAlert detektáló készlet LT alkalmazásával.

A kezelés dózisa és időtartama a jelzett. Louis, MO vásároltuk. A transzfekció utáni 16 órás kezdeti tápközeg megváltoztatása után a vírus felülúszót 48 és 72 óra elteltével gyűjtöttük össze, majd osztottuk és ° C-on tároltuk a következő kísérletekhez.

A felhasznált primer antitestek hígításait és katalógusszámát a 2. Mosás után a membránt HRP-vel konjugált szekunder antitestekkel inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. Húsz mikroliter utólag tisztított felülúszót tartottunk bemenetként. Az immunprecipitátumokat 5 percig 4 ° C-on tartottuk többszörös mosással alacsony sótartalmú pufferben mM nátrium-kloriddal, nagy sótartalmú pufferrel, mM NaCl-dal, LiCl-puffert mM LiCl-mal és végül a TE-pufferrel.

Ezt követően a Neuroendokrin rák xenograft fenol-kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk.

A prosztatarák sejtjeit a TSP1 promoter luciferáz konstrukciójával és TK-renilla luciferáz konstrukcióval együtt transzfektáltuk, amely a transzfekciós hatékonyság normalizálására szolgáló belső kontroll. A luciferáz aktivitásokat szentjánosbogár és renilla luciferáz a Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega alkalmazásával határoztuk meg.

HU0400006A2 - Antineopláziás kombinációs készítmények - Google Patents

Növekedési faktor redukált Matrigel-t Corning 4 ° C-on felolvasztottunk, és 50 μl-t gyorsan hozzáadtunk egy 96 lyukú lemez minden lyukához, és hagyjuk megszilárdulni 30 percig 37 ° C-on. A lyukakat 37 ° Neuroendokrin rák neuroendokrin rák xenograft inkubáltuk SVEC sejtekkel kondicionált tápközegben lyukanként 20 sejtés rendszeresen figyeltük a csőképződés megfigyelésére.

A képeket 4 × és 10 × nagyítás alatt vettük, és az ágak számát számszerűsítettük. Az éheztetett prosztataráksejtekből kezelt vagy nem kezelt kondicionált táptalajokat a betétek alatti mélyedésekbe vonjuk be vonzószerként. Az SVEC endoteliális sejteket 4 órán át hagyjuk migrálni, és a betéteket rögzítettük és kristályos lila festékkel festettük a migrált sejtek megfigyelésére.

A sejtmigrációt kvalitatívan elemeztük az egyes nagy teljesítményű mezőkben a migrált sejtek számának számításával. Állatkísérletek Minden állatkísérletet a Texas Egyetem Egészségügyi Központjának Állatjóléti Bizottsága által jóváhagyott protokollok követnek. Eleget tettünk minden vonatkozó etikai szabályzatnak. A terepi számítások és a szokásos gyakorlat szerint a xenograft tumor es mintamérete elegendő a különböző csoportok közötti statisztikailag szignifikáns különbségek kimutatásához.

Amikor a daganatok a nem cirkulált csoportban elérték a végpontot, a három csoport összes egerét leöltük. A xenograft összes tumorját az átlagos tumortömeg különbségeinek összehasonlítása céljából vettük fel. Nincsenek látható tumorok kizárva. A humán prosztata szöveti mikrorajka IHC festése A Baylor College of Medicine intézményi felülvizsgálati testülete által jóváhagyott klinikai protokollokon keresztül os formalin-fixált és paraffin beágyazott neuroendokrin rák xenograft vagy rákos prosztata-mintát tartalmazó TMA-t kaptunk.

A TMA-kat 60 ° C-os kemencében 2 órán át vákuumban eltávolítjuk és deparafináljuk, és xilolban és alkohol-sorozatban végzett ajak papilloma kutya rehidratáljuk. Az endogén peroxidáz aktivitás elnyomása után a szekciókat normál lószérumban inkubáltuk, hogy megakadályozzuk a nem specifikus immunoglobulin kötődését, majd egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáljuk a primer antitesttel.

Streptavidin-HRP kimutatási rendszert alkalmaztunk specifikus kötődés kimutatására. Xenograft tumorok IHC festése A xenograft tumorok immunhisztokémiai festésére 5 μm soros szekciókat deparafináltunk, rehidratáltunk és antigén-visszanyerést végeztünk 10 mM nátrium-citráttal pH 6, 0 45 percig.

A festés előtt a nemspecifikus kötődést blokkoló neuroendokrin rák xenograft blokkoló pufferként hidrogén-peroxiddal peroxidáz-szupresszorként Thermo Scientific és normál lószérummal Vector Laboratories inkubáltuk, majd 1: anti-CD31 Abcam antitestekkel inkubáltuk az antitest hígítóban Biogenex 4 ° C-on egy éjszakán át. Minden szekciót rövid idő alatt foszfáttal pufferolt sóoldattal mostuk, és szobahőmérsékleten inkubáltuk torma-peroxidázzal konjugált szekunder anti-nyúl antitesttel.

A magokat kék színnel hematoxilinnel Sigma Aldrich állítottuk be, és a VectaMount Permanent szerelési közegbe Vector Laboratories szereltük fel. A festés emberi papillomavírus indukálta szemölcsöket kontrolljaként az IgG izotípus kontrollokat alkalmaztuk. Microvessel sűrűség A tumorszövetek MVD-jét a CD31 endothel markerek immunhisztokémiai analízisével határoztuk meg, és a korábban leírt neuroendokrin rák xenograft határoztuk meg.

Az immunfestett részeket először kis nagyítással × 50 szkríneltük, hogy azonosítsuk a neovaszkularizáció forró pontjait.

Minden sárga-barna festett endoteliális sejtet vagy endoteliális sejtcsoportot, amely egyértelműen elkülönül a szomszédos mikrovesszertektől, a tumorsejtektől és más kötőszöveti elemektől, egyetlen, számlálható mikrovesszernek tartották. A forró helyszínen belül az átlagos daganatszám három forró ponton, szoros nagyítással, minden tumor szakaszban az MVD értékének tekinthető. A festett tárgylemezeket két nyomozó értékelte, akiknek konszenzusa volt. Ezekből a forrásokból származó transzformált és normalizált génexpressziós értékeket használtuk fel elemzésünkben és statisztikai számításunkban.